2021年1月，Nature Biotechnology杂志同期发布了两篇关于scCUT&Tag技术应用的文章，揭开了单细胞表观调控的新篇章。应用较多的scRNA-seq在组织异质性探究上起到了十分重要的作用；scATAC-seq技术的应用是探索单个细胞转录调控的关键，单个细胞的开放染色质区域捕获使得转录因子在单个细胞的作用被进一步揭示；scCUT&Tag技术能更深层次的探究转录因子或者组蛋白修饰在单细胞层面的转录调控。这种单细胞层面的表观多组学研究使得我们探索单细胞世界的步伐更向前迈进了一步。今天我们主要来介绍一下scCUT&Tag技术，之后，我们会慢慢为大家详解scCUT&tag的技术应用。

1、实验简介

CUT-Tag是蛋白质-DNA互作关系研究的新方法，是通过针对靶蛋白（如转录因子、染色质重塑蛋白）的抗体和Protein A的介导，使得与Protein A融合的Tn5酶(Tagmentase)在切割DNA片段的同时在序列两端加上测序接头，经PCR扩增后形成可以直接用于高通量测序的文库。随后对文库进行测序分析，探究目的蛋白结合的DNA片段。单细胞CUT&Tag实验在bulk CUT&tag的基础上加入了10x单细胞捕获，将每个细胞标记上特定的barcode，实现单细胞分辨率的蛋白-DNA互作关系研究。

 

2、实验原理

对细胞进行膜渗透性处理，随后利用抗体捕获目的蛋白，并通过二抗放大信号。将ProteinA连接Tn5转座酶，Tn5转座酶经过改造，添加测序接头。利用Protein A识别并结合抗体和二抗，在Mg2+作用下，激活转座反应，将目的蛋白结合DNA片段进行切割，并添加测序接头。随后经过10x上机进行单细胞捕获，将每个细胞的酶切DNA片段加上特定的barcode进行标记，后续加捕获的DNA进行PCR扩增，测序、生信分析探究目的蛋白和DNA相互关系。

 

3、实验流程

4、分析流程

 

5、样本要求

Ø 总量 > 10⁵ 目标细胞个数（最少 10,000 个细胞）；

Ø 细胞间无粘连（成团率 <5%）；

Ø 无大于 40um 的细胞碎片或其他颗粒物；

Ø 细胞成活率应大于 85%（台盼蓝染色检测）；

Ø 样本基因组完善

Ø 抗体需要有ChIP级别

 

6、测序数据量

测序数据量：200 M reads

 

7、项目周期

项目周期：60个工作日

 

参考文献

Single-cell CUT&Tag analysis of chromatin modifications in differentiation and tumor progression
单细胞CUT&Tag分析不同分化和肿瘤进程中的染色质修饰

 

研究背景

单细胞基因表达和单细胞开放区域捕获实验条件已经十分成熟，但是单细胞层面的特异组蛋白修饰的染色质区域捕获技术仍然是挑战。本文采用scCUT&Tag技术研究不同的组织中组蛋白修饰情况。本文主要使用H3K27me3抗体标记人胚胎干细胞中PcG沉默区域并对这些区域进行单细胞捕获和文库构建。结果表明H3K27me3的scCUT&Tag图谱可以区分人血液中的细胞类型，并可以从异质性组织中生成细胞类型特异性的PcG图谱。此外，作者使用scCUT&Tag对一名脑肿瘤患者治疗前后的H3K27me3进行了分析，鉴定了肿瘤微环境中的细胞类型以及治疗前后样本中PcG活性的异质性。

scCUT&Tag（H3K27me3）结果图

 

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