ChIP-seq/qPCR实验我们经常在文章里看到，作为表观技术的中流砥柱，ChIP也深得表观研究者的心，这么重要的实验，相信很多老师都会进行尝试，但是大部分老师对于新的实验技术都是借鉴参考文献的步骤，这里呢，爱基百客生物拥有了5000+的实验经验，给大家分享下ChIP中的注意要点。

 

ChIP实验中，IP是非常重要并且有一定技术含量的步骤，在这步骤中，涉及到一些关键点我们来一一解说。

01 input、IP、IgG

我们经常看到文章里有input出现，那么input是什么，用来做什么的呢？这里，我们来详细聊聊它吧。Input实际上就是我们要IP前的溶液中取部分出来进行纯化和建库，取出来的溶液我们称为input，它本质上就是一个常规的DNA文库，与我们的重测序文库类似，但是后续分析时作用不同。在整个ChIP实验过程中，input在IP-WB和后续ChIP-qPCR中，作为阳性对照；在ChIP实验的后续生信分析过程中，是作为背景的，分析流程中，我们需要将IP建库得到的reads去除该位点上input的reads影响，后续我们也会进行详解，这里就不多说了。说到ChIP-qPCR，我们要重点强调一点，ChIP-qPCR中，大家会关注%input，这时候就需要详细记录好input取样时占总体容积的比例了，比如1000 ml中取20 μl作为input，那么计算%input时IDF（Input Dilution Factor）就是50。

 

IP就不用解释了吧，就是我们用目的蛋白对应的抗体进行抗体-抗原免疫反应，最后将目的蛋白互作的DNA富集后纯化建库，也就是整个ChIP实验中的核心-免疫共沉淀实验了。

 

IgG用来干什么呢？IgG通常作为我们目的蛋白的阴性对照来进行实验的（此处强调一波：IgG是一抗，大家不要搞混了），理论上IgG是不能特异性富集任何的DNA片段。所以如果我们后续需要做seq的话，是不建议做IgG，因为后期建库一定会失败（不要问我为什么，不然IgG知道了肯定要跳出来说一句：没有DNA，拿什么建库呢），那么是都不用做么？这个也不是，在ChIP-qPCR中，关键点是需要计算出样本的富集倍率，这个时候就是IgG发挥作用的时候了，我们需要将IP产物的CT值来相对阴性组IgG的CT值来计算富集倍率，上一波ChIP-qPCR的计算公式吧：

ΔCt [normalized ChIP] = (Ct [ChIP] - (Ct [Input] -Log2 (Input Dilution Factor)))

% Input = 2 (-ΔCt [normalized ChIP]) 

ΔΔCt [ChIP/NIS] = ΔCt [normalized ChIP] - ΔCt[normalized NIS/mock]

Fold Enrichment = 2 (-ΔΔCt [ChIP/NIS]) 

图：IP-WB结果展示

 

02 实验抗体选择

我们一直跟客户强调ChIP实验中，一定要选择ChIP级别抗体。为什么呢？其他级别抗体不可以么？要解答这个问题，我们要先了解下抗体说明书上抗体级别评判问题。我们去抗体公司的官网上进行查看，我们会发现，不同的抗体应用范围不一样，就算是名称一样的抗体，也有应用类型的差别。如有的抗体只写了WB，有的写了WB、IHH、IF等，只有极少数的抗体应用类型上写到了ChIP。这些应用类型不是说写了WB就不能做其他实验，而是代表抗体公司没有测试或者测试失败。对于没有测试的抗体，如只有WB级别的抗体，而老师坚持要用在ChIP实验上，也是可以的，但是我们要知道，这是需要承担试错的风险，因为这个抗体不一定能在ChIP实验中成功，并且失败的可能性比较大。而那些写了应用类型有ChIP的抗体（即所谓的ChIP级别抗体），首先能够保证在它已经试验的样本中，ChIP结果能够复现（当然也不是说能够适用所有样本，但是毕竟风险要小一些）。所以我们回头来回答开头的问题了，为什么要尽量选择ChIP级别抗体，当然是ChIP级别抗体风险更小一些啊，如果是经费充足，愿意试错，那也是ok的呀，这也是为后人做出贡献不是。

 

03 磁珠选择

在进行了一抗孵育之后，我们需要用一定的办法将一抗富集到的目的蛋白进行拉取，进而获得互作DNA。常用的办法就是用磁珠了。在磁珠的选择上，有protein A、protein G或者是Protein A/G的磁珠，选择哪种磁珠更合适呢？我们来看看下表吧：

图：IP-WB结果展示

04 其他注意事项

除了以上介绍的外，还有如IP实验的buffer（pH、浓度等）、洗脱温度、时间等都对最终结果有影响。所以，ChIP实验需要有大量的经验才能保证成功。自己实验的话，一定要提前尝试多种条件进行优化哦。

 

好了，介绍了这么多，大家有没有对ChIP的IP过程有了深入了解呢？爱基百客生物的ChIP实验，好评不是吹的，文章数量是靠客户堆的。

 

话不多说，ChIP实验有困难，找爱基。爱基百客致力于研究各种疑难样本的表观技术研发，竭尽微薄力量为表观技术添砖加瓦。

 

 

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